HPV detecție tipuri cu risc crescut + genotipare extinsă

Informaţii generale şi recomandări

Conform datelor actuale infecția persistentă cu genotipuri HPV de risc crescut (oncogene, hrHPV) reprezintă condiția necesară pentru dezvoltarea cancerului cervical și a leziunilor sale precursoare. Practic, prezența tipurilor HPV oncogene a fost demonstrată în aproape toate cazurile de cancer cervical.

Genotipul HPV 16 este considerat cel mai carcinogen, fiind responsabil de aproximativ 55-60% din toate cancerele cervicale. Este urmat de genotipul HPV 18 ce este implicat în 10-15% din cazuri, mai frecvent în cancerele glandulare, adenocarcinoame și carcinoame adenoscuamoase decât în carcinoamele cu celule scuamoase. Aproximativ alte 10 genotipuri HPV cauzează restul de 25-35% din cancerele cervicale¹.

În 2012 Agenția Internațională pentru Cercetare în Domeniul Cancerului (IARC) a concluzionat că sunt dovezi suficiente privind implicarea în carcinogeneza cervicală a 12 tipuri HPV de risc crescut (HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 and HPV59), acestea fiind considerate carcinogene 1A. Pentru HPV68 există mai puține dovezi, motiv pentru care a fost considerat carcinogen 2A (probabil carcinogen). În plus, alte 7  tipuri HPV înrudite filogenetic (HPV26, HPV53, HPV66, HPV67, HPV70, HPV73 și HPV82) au fost identificate în infecții HPV unice în anumite cazuri rare de cancer cervical, fiind considerate astfel posibil carcinogene (carcinogene 2B). Într-un studiu recent, Halec et al au arătat că cele 8 tipuri HPV probabil/posibil carcinogene (grupurile 2A si 2B) sunt biologic active în infecțiile unice și afectează aceleași căi celulare ca și tipurile HPV considerate pe deplin carcinogene (grupul 1A). Cercetătorii au constatat de asemenea că adăugarea la grupul celor 13 tipuri HPV cu risc crescut (carcinogene 1 și 2A) a celor 7 tipuri HPV posibil carcinogene a crescut cu 2.6% procentul cancerele cervicale HPV pozitive. Din acest motiv, s-ar impune o nouă clasificare a tipurilor HPV carcinogene. Cu toate acestea, având în vedere faptul că sunt foarte rar implicate în cancerele cervicale nu este necesar ca genotipurile HPV din categoria 2B să fie incluse în testele de screening sau vaccinuri^2;3.

Stabilirea legăturii cauzale între HPV și cancerul cervical alături de înțelegerea epidemiologiei și a evoluției naturale a infecției HPV a condus la un nou model de carcinogeneză cervicală: achiziționarea HPV, persistența HPV (vs clearance), progresia către leziuni premaligne și invazia. Cele mai multe infecții HPV sunt tranzitorii fiind eliminate de către sistemul imun al gazdei în decurs de 1-2 ani. Infecțiile persistente se asociază cu un risc crescut de apariție a leziunilor precanceroase. Astfel, persistența timp de 1 an sau 2 ani, în special a HPV16, prezintă un risc de 20-30% de dezvoltare a CIN3 sau de leziuni mai avansate (CIN3+); CIN3 netratat are 30% probabilitate de a conduce la cancer cervical invaziv în decurs de 30 ani, în timp ce doar 1% din CIN3 tratate vor deveni invazive¹.

Scopul fundamental al screening-ului cancerului cervical este de a preveni morbiditatea și mortalitatea prin acest timp de cancer. O strategie optimă de screening este aceea de a identifica leziunile precursoare capabile să progreseze către cancer invaziv și în același timp de a evita detectarea infecțiilor HPV tranzitorii. Examenul citologic Babeș-Papanicolaou a redus mult incidența cancerului cervical în țările care au adoptat programe de screening eficiente. Cu toate acestea, s-au descris limitări importante ale citologiei, printre care se numară o sensibilitatea redusă (50-60%) și de asemenea o specificitate scazută, ceea ce conduce la necesitatea repetării screening-ului la intervale scurte de timp^1;4.

Introducerea în clinică a testării HPV a avut ca scop îmbunătățirea ratei de detecție a leziunilor premaligne și a cancerului cervical. Pentru un screening adecvat este necesară doar testarea hrHPV și nu a genotipurilor HPV cu risc scăzut¹.

Inițial testarea hrHPV a fost utilizată pentru triajul citologiilor echivoce (ASC-US), ulteori s-a introdus în SUA cotestarea citologie Pap + hrHPV ADN la femeile ≥ 30 ani, iar în ultimii anit, mai multe studii au arătat potențialul testelor hrHPV de a fi utilizate în screening-ul primar al cancerului cervical datorită sensibilității crescute în detectarea leziunilor scuamoase intraepiteliale de grad înalt și a valorii predictive negative foarte bune. Cu toate acestea, în studiul Horizon s-au constatat diferențe considerabile între rezultatele obținute prin diverse hrHPV în screening-ul primar al cancerului cervical la femei peste 30 ani⁵.

Aceste diferențe se datorează faptului că testele HPV variază în capacitatea lor de a detecta infecțiile tranzitorii vs infecțiile clinic relevante (infecții asociate cu leziuni CIN2+ sau având un risc crescut de conduce la CIN2+, vezi figura de mai jos).

Figura 1: Rolul HPV în oncogeneza cervicală – tipuri de infecție HPV
(Adaptare după Meijer C. Regulation of HPV tests, Melbourne 2015)

Din această perspectivă, testele HPV  pot fi clasificate în 2 categorii:

• teste cu sensibilitate și specificitate analitică crescută: detectează toate infecțiile cauzate de hrHPV (atât cele tranzitorii cât și pe cele cu relevanță clinică);
• teste cu sensibilitate și specificitate clinică crescută: detectează doar infecțiile HPV clinic relevante.

În practică, selectarea testelor HPV se va face în funcție de scopul urmărit:

• testele cu sensibilitate și specificitate analitică crescută sunt utile în studii epidemiologice, pentru stabilirea eficacității vaccinurilor și monitorizarea prevalenței HPV
• teste cu sensibilitate și specificitate clinică crescută sunt utile în screening-ul cancerului cervical, triajul citologiei echivoce, monitorizarea post-intervenție pentru CIN2+.

Astfel, pentru un screening adecvat al cancerului cervical este esențial să se utilizeze teste HPV care să detecteze infecțiile clinic relevante și să ignore infecțiile tranzitorii (asociate cu niveluri joase ale încărcăturii virale). Acest lucru presupune o validare clinică obligatorie:

• valoarea testului să fie demonstrată în studii prospective mari

sau

• testul să demonstreze o non-inferioritate vs testul HPV standard (Hybrid Capture 2, HC2) în studii clinice de echivalență.

Un consorțiu international a stabilit cerințele pe care trebuie să îndeplinească un test HPV pentru a fi util în screening-ul cancerului cervical:

→ să prezinte o sensibilitate clinică pentru CIN2+ de cel puțin 90% din cea a testului de standard

→ să demonstreze o specificitate clinică pentru CIN2+ de cel puțin 98% din cea a testului standard

→ să prezinte o bună reproductibilitate a rezultatelor intra- laborator și să demonstreze o concordanță de minimum 87% inter-laboratoare (în acest scop este necesară testarea a cel puțin 500 de probe, dintre care o treime să fie pozitive la un test HPV validat clinic)^6;7.

Noul test de screening BD Onclarity HPV  realizat pe platforma analitică VIPER LT (Becton-Dickinson) detectează 14 tipuri HPV cu risc crescut cu genotiparea individuală a tipurilor HPV 16, 18, 31, 45, 51, 52 și cu raportarea celorlalte tipuri HPV în grupuri de 2 sau 3 virusuri: P1: 33/58; P2: 56/59/66; P3: 35/39/68. Are la bază o metodă real-time PCR în care sunt amplificate secvențe țintă specifice de la nivelul genelor E6 și E7. Spre deosebire de majoritatea testelor HPV în care sunt amplificate regiuni conservate ale genomului viral prin intermediul primerilor PCR de consens pentru secvența L1, testul BD Onclarity HPV permite amplificarea regiunilor genomice specifice tipurilor HPV îmbunătățind astfel specificitatea detecției. În plus,  prin alegerea secvențelor țintă la nivelul genelor E6 și E7 nu există riscul de a obține un rezultat fals-negativ în cazurile rare  în care s-a produs deleția regiunii L1 ca urmare a integrării genomului viral în genomul celulei gazdă. Un alt avantaj potențial al noului test este acela că genotiparea extinsă ar putea conduce la o evaluare mai precisă a persistenței genotipurilor HPV specifice la femeile care participă la programele de screening și în final la o stratificare mai bună a pacientelor în funcție de gradul de risc^8;9;10.

Validarea clinică a testului BD Onclarity HPV s-a realizat conform recomandărilor consorțiului internațional. Astfel, analiza de specificitate clinică s-a efectuat pe un subset dintr-o populație de 6000 femei care s-au prezentat la screening-ul de rutină la St Mary’s Hospital, Londra. Selecția finală a inclus 4599 probe de citologie la care nu s-au detectat leziuni CIN2+ conform procedurilor standard de diagnostic. Analiza de sensibilitate clinică s-a efectuat pe un subset dintr-o populație de 1099 de femei care au fost trimise la clinici de colposcopie de la Hammersmith și St Mary’s Hospital, Londra. Selecția finală a inclus 156 probe de la paciente cu diagnostic confirmat de CIN2+. În ambele cazuri au fost incluse femei ≥30 ani. Toate probele au fost analizate atât cu BD Onclarity HPV cât și cu testul HPV standard HC2. Analiza reproductibilității s-a efectuat prin testarea a 512 probe cu testul HC2, iar 147 probe HC2 pozitive și 365 probe HC2 negative au constituit setul de probe pentru testarea reproductibilității testului BD Onclarity. Rezultatele obținute au indicat faptul că testul BD Onclarity HPV are o sensibilitate clinică de 93% (vs 94.2% HC2) și o specificitate clinică de 87.7% (vs 88.8% HC2); testul a demonstrat o reproductibilitate a rezultatelor intra-laborator de 98.6% și o concordanță interlaboratoare de 98.4%. În concluzie, testul prezintă o performanță similară cu cea a HC2⁸.

Într-un alt studiu recent, 541 probe de citologie reziduale, colectate în mediul BD Sure Path, provenite de la paciente <35 ani incluse în studii clinice multicentrice, au fost selecționate în vederea testării cu BD Onclarity HPV. Acest set a cuprins 104 probe de la paciente cu diagnostic de CIN2 confirmat prin biopsie, 79 probe cu citologie anormală dar având leziuni < CIN2 la biopsie și 350 probe cu citologie negativă pentru leziuni intraepiteliale sau maligne (NILM) și cu leziuni < CIN2 la biopsie. Performanța testului BD Onclarity HPV efectuat pe probe colectate în mediul BD Sure Path a fost comparată cu cea a testului HC2 efectuat pe probe recoltate concomitent dar pe mediul STM (specimen transport medium). Sensibilitatea testului BD Onclarity HPV pentru CIN2 a fost de 90.4% (vs 93.3% HC2) iar specificitatea pentru CIN2 de 76.9% (vs 77.8%). 9 cazuri cu biopsie pozitivă pentru CIN2 au avut rezultate discordante la cele 2 teste, însă la secvențierea prin metoda DHPLC (denaturing high-performance liquid chromatography) s-a dovedit că acestea au fost corect clasificate cu BD Onclarity HPV. S-a arătat astfel că testul BD Onclarity HPV nu prezintă interferențe cu genotipurile HPV de risc scăzut și este capabil de asemenea să furnizeze cu acuratețe informații de genotipare și în cazul infecțiilor HPV mixte⁹.

Pregătire paciente – se va evita recoltarea probei în perioada menstruală. De asemenea, 48 ore înainte de prelevarea probei, pacientele vor evita:

• raporturile sexuale;
• efectuarea duşurilor vaginale;
• folosirea tampoanelor intravaginale, contraceptivelor locale, a diverselor geluri, creme şi tratamente vaginale¹⁰.

Specimen recoltat – celule ale zonei exocervicale, endocervicale şi de tranziţie dintre acestea (zona de transformare). Zona de transformare reprezintă sediul cel mai frecvent al leziunilor preneoplazice (turn-over crescut, expusă microtraumatismelor, sensibilitate crescută la acţiunea HPV), acolo unde epiteliul scuamos al exocolului se continuă cu cel de tip glandular de la nivel endocervical prin intermediul unei zone de metaplazie scuamoasă; recoltarea se efectuează cu ajutorul periuţei cervicale cu cap detaşabil (vezi fig.1). Pentru recoltarea în mediu lichid sunt recomandate dispozitivele din plastic. După recoltare, partea detaşabilă a instrumentului este introdusă în flaconul cu mediu lichid Surepath (același ca pentru citologia în mediu lichid, vezi figura 2) fără a se efectua alte manevre asupra suprafeţei care conţine materialul celular.

                     Fig. 1 Periuţa Cervex-Brush                                          Fig. 2 Flacon cu mediu lichid Surepath.

Instrucţiuni de recoltare – După vizualizarea colului uterin se inseră partea centrală a periuţei în canalul endocervical astfel încât marginile mai scurte să vină în contact cu exocervixul. De obicei nu se recomandă ştergerea colului uterin înainte de recoltare, dar la nevoie se poate tampona uşor cu un tifon. Cu partea centrală fixă, se roteşte complet periuţa în sensul acelor de ceasornic de cinci ori. Proba astfel recoltată trebuie imediat fixată pentru a se evita deteriorarea probei. În acest scop se detaşează capătul periuţei care conţine materialul recoltat şi se introduce în recipientul cu mediu lichid (vezi fig.3)¹⁰.

Fig. 3 Detașarea capătului periuței

Stabilitate probă – celulele cervicale colectate în mediul BD SurePath sunt stabile cel puțin 2 luni  la 2-8ºC⁹.

Metodă – Real-time PCR utilizând primeri specifici pentru amplificarea ADN-ului și sonde oligonucleotidice marcate fluorescent pentru detecția produșilor de amplificare. Reactivii sunt conținuți în 3 tuburi (G1, G2 și G3) fiind capabili să detecteze 14 hrHPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 și 68) precum și un control intern reprezentat de un fragment ADN din gena beta-globinei. De asemenea, la fiecare rulare a probelor se utilizează BD Onclarity HPV Positive Control și  BD Onclarity HPV Negative Control. Vor fi genotipate individual tipurile HPV 16, 18, 31, 45, 51, 52 iar celelalte tipuri HPV vor fi raportate în grupuri de 2 sau 3 virusuri: P1: 33/58; P2: 56/59/66; P3: 35/39/68¹⁰.

Valori de referinţă și raportarea rezultatelor

Valori de referință: HPV ADN pentru 14 genotipuri de risc crescut – nedetectabil.

În cazul unui rezultat HPV ADN pentru 14 genotipuri de risc crescut pozitiv se va raporta genotipul sau grupul de genotipuri pentru care s-a obținut un rezultat pozitiv¹⁰.

Limite și interferențe

Prezenţa de sânge sau mucus în probă nu interferă cu testul¹⁰.

Bibliografie

1. Saslow D, Solomon D, Lawson HW, Killackey M, Kulasingam SL, Cain J,et al. American Cancer Society, American Society for Colposcopy and Cervical Pathology, and American Society for Clinical Pathology screening guidelines for the prevention and early detection of cervical cancer. See comment in PubMed Commons belowAm J Clin Pathol. 2012 Apr;137(4):516-42.
2. Arbyn M, Tommasino M, Depuydt C, Dillner J. Are 20 human papillomavirus types causing cervical cancer? J Pathol. 2014 Dec;234(4):431-5.
3. Halec G, Alemany L, Lloveras B, Schmitt M, Alejo M, Bosch FX, et al. Retrospective International Survey andHPV Time Trends Study Group. Pathogenic role of the eight probably/possibly carcinogenic HPV types 26, 53, 66, 67, 68, 70, 73 and 82 in cervical cancer. J Pathol. 2014 Dec;234(4):441-51. 
4. Melon S, Alvarez-Argüelles M, de Oña M. Molecular Diagnosis of Human Papillomavirus Infections. In Human Papillomavirus and Related Diseases – From Bench to Bedside A Diagnostic and Preventive Perspective. InTech 2013.
5. Rebolj M, Preisler S, Ejegod DM, Rygaard C, Lynge E, Bonde J. Disagreement between human papillomavirus assays: an unexpected challenge for the choice of an assay in primary cervical screening. PLoS One. 2014 Jan 20;9(1):e86835.
6. Meijer C. Regulation of HPV tests, Melbourne 2015. Reference Type: Internet Communication.
7. Meijer CJ, Berkhof J, Castle PE, Hesselink AT, Franco EL, Ronco G, et al. Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. See comment in PubMed Commons belowInt J Cancer. 2009 Feb 1;124(3):516-20.
8. Ejegod DM, Serrano I, Cuschieri KS, Nussbaumer WA, Vaughan LM, Ahmad AS et al, Clinical Validation of BD Onclarity^TM HPV AssaY Using a Non-Inferiority Test. J Med Microb Diagn 2013, S3: 003.
9. Wright TC Jr, Stoler MH, Agreda PM, Beitman GH, Gutierrez EC, Harris JM, et al. Clinical performance of the BD Onclarity HPV assay using an adjudicated cohort of BD SurePath liquid-based cytology specimens. Am J Clin Pathol. 2014 Jul;142(1):43-50.
10. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog.