Celule tumorale circulante (CTC)

Informații generale

Incidența cancerului în întreaga lume a crescut rapid din cauza îmbătrânirii populației, a poluării mediului sau a stilului de viață nesănătos. Conform GLOBOCAN, numărul cazurilor noi de cancer și al deceselor cauzate de cancer la nivel mondial a atins circa 12,7 milioane, respectiv 7,6 milioane în 2008, număr ce a crescut la aproximativ 14,1 milioane și, respectiv, 8,2 milioane în 2012¹.

În ciuda îmbunătățirilor remarcabile în ceea ce privește diagnosticul precoce al cancerului precum și tratamentul chirurgical al tumorii primare, boala metastatică este responsabilă pentru mai mult de 90% din decesele cauzate de cancer². În prezent, conform statisticilor OMS, peste 8 milioane de persoane în întreaga lume mor anual ca urmare a bolii metastatice³.

În procesul de metastazare, celulele tumorale invadează țesutul înconjurător al tumorii primare, pătrund  în vasele sanguine și limfatice, migrează la distanță, extravazează din circulație, se adaptează noului micromediu și în cele din urmă proliferează și colonizează pentru a forma metastaze⁴.

Celulele tumorale circulante (CTC) sunt celule tumorale eliberate în sângele periferic dintr-o leziune primară sau metastatică, fie spontan, fie printr-o procedură chirurgicală (diagnostică sau terapeutică). Acestea pot apărea în sânge precoce, înainte ca leziunile metastatice să fie detectate prin metode imagistice¹. Pentru ca celulele să fie mobilizate din tumora solidă primară se presupune că acestea trebuie să sufere o modificare fenotipică, denumită tranziție epitelio-mezenchimală, ce favorizează desprinderea de celulele învecinate, navigarea prin matricea extracelulară locală și pătrunderea acestora în microcirculație⁵.

Ipoteza conform căreia CTC sunt o condiție fundamentală în procesul de metastazare a fost propusă pentru prima oară la mijlocul secolului al XIX-lea de Thomas Ashworth, un patolog australian [Ashworth, 1869].

Astăzi, identificarea și caracterizarea moleculară a CTC rămân esențiale pentru evaluarea riscului de progresie și supraviețuire la pacienții cu cancer metastatic – posibil și la cei cu cancer în stadiu incipient – precum și în ghidarea terapiei oncologice. Numărul crescut de CTC se corelează cu o boală agresivă, riscul înalt de metastazare și timpul redus până la recădere, astfel că CTC constituie un biomarker predictiv important^1;4.

Deoarece CTC sunt extrem de rare (1 CTC la 10⁶-10⁷ leucocite în sângele periferic al pacienților cu cancer) izolarea și identificarea lor au fost extrem de dificile, chiar și la pacienții cu progresia bolii metastatice. De exemplu, numai 1,43% dintre pacienții cu cancer de sân progresiv au prezentat peste 500 CTC/ 7,5 ml de sânge². Un alt obstacol major pentru detectarea CTC este heterogenitatea acestora. În acest sens, sunt descrise variații semnificative ale caracteristicilor morfologice și profilului imunofenotipic nu numai în cazul CTC derivate din țesuturi diferite, ci și în cadrul CTC provenite din același țesut⁶. De asemenea, o subpopulație potențial metastatică de CTC poate fi în prezent nedetectabilă, ca urmare a interacțiunii cu plachetele sangvine, ce realizează un „scut” în jurul celulor tumorale și le conferă astfel o protecție față de sistemul imun. Din acest motiv, trombocitoza este asociată cu un prognostic rezervat în multe tipuri de cancer⁴.

Pe de altă parte, nu toate CTC  sunt relevante din punct de vedere clinic. Pacienții cu diferite afecțiuni inflamatorii sau benigne au, de asemenea, celule epiteliale circulante viabile, detectabile. În plus, într-un studiu efectuat pe un model murin de cancer pancreatic, au fost depistate CTC în sânge înainte de apariția tumorii primare. Astfel, testele CTC actuale sunt limitate în posibilitatea diferențierii celulelor tumorale de cele nontumorale⁴.

Detectarea CTC variază în mare măsură în funcție de tehnologia utilizată pentru izolarea lor. Majoritatea platformelor disponibile în prezent se bazează pe identificarea unor markeri de suprafață sau a proprietăților fizice pentru a distinge CTC de componentele sanguine normale³. Aceste tehnologii sunt evaluate inițial pe linii celulare, fiind analizate numeroase caracteristici de performanță (eficiența/recuperarea captării, diferențierea de leucocite, viabilitatea celulară, viteza de procesare, capacitatea de eșantionare a sângelui) și apoi validate clinic⁶. Cu toate acestea, cercetătorii se confruntă adesea cu diferite provocări metodologice, fapt ce limitează implementarea clinică a testelor CTC și interpretarea corectă a rezultatelor⁷.

În 2004 a fost introdus Sistemul CellSearch (Veridex, Raritan, NJ), singurul dispozitiv medical aprobat în prezent în SUA de către Food and Drug Administration (FDA) pentru izolarea și cuantificarea CTC în scopul monitorizării cancerului metastatic mamar, colorectal și prostatic^2;7. Rezultatele sunt interpretate ca fiind favorabile sau nefavorabile. Astfel, detectarea a 5 sau mai multe CTC/7.5 mL sânge la pacienții cu cancer metastatic mamar sau prostatic și a 3 sau mai multe CTC/7.5 mL sânge în cazul cancerului colorectal metastatic este asociată cu o reducere atât a ratei de supraviețuire fără semne de progresie a bolii cât și a ratei de supraviețuire globală⁸.

În cele din urmă, deși s-au înregistrat progrese în ceea ce privește capacitatea de a caracteriza CTC, biologia lor nu este încă elucidată complet. Determinanții genetici și epigenetici ai invaziei celulelor tumorale, supraviețuirea celulelor în circulație și capacitatea de colonizare la distanță a organelor constituie un domeniu de cercetare intensă. Odată realizabilă, caracterizarea CTC la nivelul celulelor individuale va oferi oportunități fără precedent pentru medicina personalizată,  prin analiza biomarkerilor farmacodinamici și /sau biomarkerilor cu valoare predictivă asupra rezistenței dobândite la tratamentul oncologic².

Recomandări pentru determinarea CTC

• monitorizarea pacienților cu cancer metastatic de colon, sân sau prostată. Testul nu este validat pentru pacienții care nu prezintă boală metastatică sau alte tipuri de cancere^8;9.

Pregătire pacient – se recomandă ca probele să fie recoltate inițial înaintea chimioterapiei; în scop de monitorizare pot fi recoltate probe la 3-4 săptămâni de la inițierea terapiei; dacă pacientul urmează tratament cu doxorubicină probele vor fi recoltate după minimum 7 zile de la administrarea ultimei doze^8;9.

Specimen recoltat – sânge venos^8;9.

Recipient de recoltare – se vor utiliza doar tuburi CellSave furnizate de laborator (2 tuburi de 10 mL); vezi imagina de mai jos^8;9.

Volum probe – minim 7.5 mL sânge pentru fiecare din cele 2 tuburi; tuburile nu pot fi combinate; după fiecare recoltare se va amesteca conţinutul prin inversiunea uşoară a tubului de cca. 8 ori^8;9.

Prelucrare necesară după recoltare și transport la laborator– nu este necesară; având în vedere faptul că CTC sunt fragile și necesită o păstrare adecvată înainte de a fi analizate probele de sânge vor fi menținute și transportate în condiții ambientale doar în tuburile CellSave^8;9.

Stabilitate probă –72 ore la temperatura camerei; probele nu vor fi refrigerate sau congelate! ^8;9

Cauze de respingere a probelor

• specimene hemolizat;
• specimen recoltate în alte tuburi decât CellSave;
• specimene mai vechi de 72 ore^8;9.

Metodă – Sistemul CellSearch; analiza se realizează în următoarele etape:

• separarea magnetică a celulelor epiteliale de celelalte componente ale sângelui prin utilizarea unui reactiv ferofluid conjugat cu anticorpi monoclonali îndreptați față de molecula de adeziune a celulelor epiteliale (EpCAM);
• diferențierea CTC de leucocitele contaminante prin utilizarea a 3 markeri: DAPI (colorant fluorescent pentru nuclei), anticorpi anti-citokeratine (CK)8, 18 și 19, anticorpi anti-CD45;
• CTC au următorul fenotip: DAPI+/CD45-/CK+^8;9.

Interpretarea rezultatelor – Rezultatele sunt raportate ca fiind favorabile sau nefavorabile. Astfel, detectarea a 5 sau mai multe CTC/7.5 mL sânge la pacienții cu cancer metastatic mamar sau prostatic și a 3 sau mai multe CTC/7.5 mL sânge în cazul cancerului colorectal metastatic este asociată cu o reducere atât a ratei de supraviețuire fără semne de progresie a bolii cât și a ratei de supraviețuire globală^8;9.

Referințe

1. Liang SB, Fu LW. Application of single-cell technology in cancer research. Biotechnol Adv. 2017 Apr 5. (article in press).
2. Krebs MG, Hou JM, Ward TH, Blackhall FH, Dive C. Circulating tumour cells: their utility in cancer management and predicting outcomes. Ther Adv Med Oncol. 2010 Nov;2(6):351-65.
3. Gkountela S, Szczerba B, Donato C, Aceto N. Recent advances in the biology of human circulating tumour cells and metastasis. ESMO Open. 2016 Aug 3;1(4):e000078.
4. Plaks V, Koopman CD, Werb Z. Cancer. Science. 2013 Sep 13;341(6151):1186-8.
5. Dasgupta A, Lim AR, Ghajar CM. Circulating and disseminated tumor cells: harbingers or initiators of metastasis? Mol Oncol. 2017 Jan;11(1):40-61.
6. Harouaka R, Kang Z, Zheng SY, Cao L; Circulating tumor cells: advances in isolation and analysis, and challenges for clinical
7. applications. Pharmacol Ther. 141(2):209-21; 2014
8. Hong B, Zu Y. Detecting Circulating Tumor Cells: Current Challenges and New Trends. Theranostics. 2013 Apr 23;3(6):377-94.
9. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Circulating Tumor Cells (CTC) for Breast Cancer/Colorectal Cancer/Prostate Cancer by CellSearch, Blood. www.mayomedicallaboratories.com. 2017.
10. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.